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研究魚腥草活性成分槲皮素對腫瘤壞死因子-α/介白素-1β引起人類視網膜色素上皮細胞發炎模式之影響

為了解決small zipper pouch p的問題，作者鄭淑臻 這樣論述：

目錄指導教授推薦書………………………………………………………………………………………………………………………………………………口試委員會審定書…………………………………………………………………………………………………………………………………………誌謝………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………iii中文摘要………………………………………………………………………………………………………………………………………………………ivEnglish Abstract……………………………………………………………………………………

…………………………………………vi目錄………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………viii圖目錄…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………xiii表目錄…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………xvi縮寫對照表 (Abbreviations)……………………………………………………………………………………………………xvii抑制劑 (Inhibitors)……………………

…………………………………………………………………………………………………xix第一章 緒言……………………………………………………………………………………………………………………………………………………11.1 眼睛的構造與功能……………………………………………………………………………………………………………………………11.1.1 眼睛的基本組成及功能……………………………………………………………………………………………………………11.1.2 視網膜………………………………………………………………………………………………………………………………………………11.1.3 視網膜色素上皮細胞

(Retinal pigment epithelial cells, RPECs)……21.2 老年性黃斑部病變 (Age-related macular degeneration, AMD)……………………41.3 發炎細胞激素、趨化激素及黏附因子…………………………………………………………………………………………61.3.1 腫瘤壞死因子-α (Tumor necrosis factor-α, TNF-α)………………………………………61.3.2 介白素-1β (Interleukin-1β, IL-1β)……………………………………………………………………………91.3.3 介白素-

6 (Interleukin 6, IL-6)…………………………………………………………………………………101.3.4 介白素-8 (Interleukin 8, IL-8)…………………………………………………………………………………121.3.5 細胞間黏附分子-1 (Intercellular Adhesion Molecule-1, ICAM-1)……141.3.6 可溶性細胞間黏附分子-1 (soluble intercellular adhesion molecule-1, sICAM-1)……………………………………………………………………………………………………………………

……………………………181.3.7 基質金屬蛋白酶 (Matrix metalloproteinases, MMPs)……………………………………181.3.8 單核細胞趨化蛋白-1 (Monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)221.4 訊息傳遞路徑………………………………………………………………………………………………………………………………………231.4.1 有絲分裂原活化蛋白激酶 (Mitogen-activated protein kinase, MAPK)……………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………231.4.2 核因子-κB (Nuclear factor-kappa B, NF-κB)……………………………………………………281.4.3 蛋白激酶C (Protein kinase C, PKC)…………………………………………………………………………311.4.4 c-Jun 蛋白………………………………………………………………………………………………………………………………………331.4.5 環磷酸腺苷反應元件結合蛋白 (cAMP response element binding protein, CREB) ………………………

………………………………………………………………………………………………………………341.4.6 活化轉錄因子-2 (Activating transcription factor-2, ATF-2)…………351.4.7 活化蛋白-1 (Activator protein-1, AP-1)……………………………………………………………371.5 魚腥草 (Houttuynia cordata)………………………………………………………………………………………………381.6 槲皮素 (Quercetin)…………………………………………………………………………………………………………………

……39第二章 研究目的……………………………………………………………………………………………………………………………………………63第三章 材料與方法………………………………………………………………………………………………………………………………………653.1 研究架構及分析方法…………………………………………………………………………………………………………………………653.2 材料……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………653.2.1 化學物品和試劑………………………………………………………………………………

………………………………………………653.2.2 抗體………………………………………………………………………………………………………………………………………………………673.3 細胞培養…………………………………………………………………………………………………………………………………………………673.3.1 人類RPECs (ARPE-19 cells)………………………………………………………………………………………………673.3.2 THP-1細胞 (人類單核球細胞)………………………………………………………………………………………………693.4 細胞存活率分析 (Cell vi

ability assay)………………………………………………………………………693.5 西方墨點法分析 (Western blotting)…………………………………………………………………………………703.6 RNA萃取、反轉錄聚合酶連鎖反應 (reverse transcription-PCR, RT-PCR)及即時聚合酶連鎖反應 (Real-time polymerase chain reaction, Real-time PCR)……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………713.6.1 RNA萃取

及反轉錄聚合酶連鎖反應 (reverse transcription-PCR, RT-PCR)………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………713.6.2 即時聚合酶連鎖反應 (Real-time polymerase chain reaction, Real-time PCR)………………………………………………………………………………………………………………………………………………………723.7 酵素連結免疫分析法 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)……

…733.8 免疫螢光染色 (Immunofluorescence staining)………………………………………………………753.9 單核細胞黏附試驗 (Monocyte adhesion assay)…………………………………………………………753.10 明膠酶譜法 (Gelatin zymography)…………………………………………………………………………………763.11 AP-1、NF-κB及MMP-9螢光素酶活性分析 (Measurement of AP-1-, NF-κB- and MMP-9-luciferase (Luc) activity)………………………………

………………………………………………763.11.1 plasmids的備製…………………………………………………………………………………………………………………………763.11.2 Plasmid transient transfection……………………………………………………………………………773.11.3 螢光素酶活性測定………………………………………………………………………………………………………………………773.12 統計分析 (Statistical analysis)…………………………………………………………………………………77第四章 研究結果與討論……………………

………………………………………………………………………………………………………794.1 魚腥草活性成分的初步篩選…………………………………………………………………………………………………………804.1.1 研究背景 (Background)…………………………………………………………………………………………………………804.1.2 研究結果 (Results)…………………………………………………………………………………………………………………814.1.3 討論 (Discussion)……………………………………………………………………………………………………………………824.1.

4 圖例 (Figures and Legends)……………………………………………………………………………………………844.2 槲皮素透過下調TNF-α活化RPECs引起ICAM-1和MMP-9的表現達到抗發炎的特性…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………894.2.1 研究背景 (Background)…………………………………………………………………………………………………………894.2.2 研究結果 (Results)……………………………………………………………………………………………………

……………914.2.3 討論(Discussion)………………………………………………………………………………………………………………………974.2.4 圖例(Figures and Legends)……………………………………………………………………………………………1014.3 槲皮素透過MAPK和NF-κB訊息傳遞路徑抑制IL-1β誘導ARPE-19細胞發炎細胞激素和趨化激素的產生………………………………………………………………………………………………………………………………………1174.3.1 研究背景 (Background)…………………………………………………………………

……………………………………1174.3.2 研究結果 (Results)………………………………………………………………………………………………………………1194.3.3 討論 (Discussion)…………………………………………………………………………………………………………………1234.3.4 圖例(Figures and Legends)……………………………………………………………………………………………128第五章 結論…………………………………………………………………………………………………………………………………………………141Publications……………………

………………………………………………………………………………………………………………………143References…………………………………………………………………………………………………………………………………………………144圖目錄圖1-1、人類眼球的基本結構…………………………………………………………………………………………………………………42圖1-2、人類的視網膜…………………………………………………………………………………………………………………………………42圖1-3、人類的視網膜分層………………………………………………………………………………………………………………………43

圖1-4、視網膜色素上皮的結構與功能………………………………………………………………………………………………44圖1-5、AMD疾病的分期………………………………………………………………………………………………………………………………45圖1-6、AMD疾病的分期、臨床特徵及治療………………………………………………………………………………………46圖1-7、缺血性AMD相關的反應機制……………………………………………………………………………………………………47圖1-8、TNF-α訊息傳遞路徑……………………………………………………………………………………………………………………48圖1-9、

IL-6訊息傳遞路徑………………………………………………………………………………………………………………………49圖1-10、IL-6的多效性……………………………………………………………………………………………………………………………50圖1-11、IL-6和眼科相關的疾病…………………………………………………………………………………………………………52圖1-12、ICAM-1的結構……………………………………………………………………………………………………………………………53圖1-13、PMN的捕獲、滾動、牢固黏連和跨內皮遷移…………………………………………………………………54圖1-

14、MMPs結構………………………………………………………………………………………………………………………………………55圖1-15、經典和非經典的NF-κB訊息傳遞路徑………………………………………………………………………………58圖1-16、魚腥草形態……………………………………………………………………………………………………………………………………59圖1-17、魚腥草抗發炎機制的示意圖…………………………………………………………………………………………………59圖1-18、槲皮素的化學結構和來源………………………………………………………………………………………………………60圖1-1

9、槲皮素臨床應用及眼科的研究……………………………………………………………………………………………61圖1-20、槲皮素在實驗模型的抗發炎作用………………………………………………………………………………………61圖1-21、探討槲皮素在眼科抗發炎的研究………………………………………………………………………………………62圖4-1、魚腥草水萃濃縮液之HPLC指紋圖譜……………………………………………………………………………………84圖4-2、魚腥草酒萃濃縮液之HPLC指紋圖譜……………………………………………………………………………………85圖4-3、槲皮素、蘆丁、油酸、綠原酸及R(+)檸檬烯

之細胞存活率分析…………………………86圖4-4、槲皮素改善TNF-α刺激ARPE-19細胞引起ICAM-1的表現…………………………………………87圖4-5、TNF-α刺激ARPE-19細胞引起ICAM-1和MMP-9的表現……………………………………………101圖4-6、槲皮素改善TNF-α刺激ARPE-19細胞引起ICAM-1和MMP-9的表現……………………103圖4-7、槲皮素抑制TNF-α刺激ARPE-19細胞誘導PKCδ-JNK1/2-c-Jun訊息傳遞路徑的活化……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

………105圖4-8、槲皮素抑制TNF-α刺激ARPE-19細胞誘導MEK1/2-ERK1/2訊息傳遞路徑的活化………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………107圖4-9、槲皮素藉由抑制NF-κB (p65)訊息傳遞路徑改善TNF-α誘導ARPE-19細胞ICAM-1和MMP-9的表現……………………………………………………………………………………………………………………………109圖4-10、槲皮素藉由抑制PKCδ-JNK1/2訊息傳遞路徑減少TNF-α誘導ARPE-19細胞產生的NF-κB (p65)磷酸化、

轉位及啟動子活性……………………………………………………………………………111圖4-11、槲皮素藉由PKCδ、ERK1/2、JNK1/2、c-Jun和NF-κB (p65)訊息傳遞路徑來減少TNF-α刺激ARPE-19細胞誘導THP-1細胞黏附作用和MMP-9啟動子活性…………………113圖4-12、槲皮素改善TNF-α刺激ARPE-19細胞引起ICAM-1和MMP-9表現的訊息傳遞路徑示意圖…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………115圖4-13、IL-1β刺激ARPE-19細胞引起IL-6、IL-8、MCP-1、

sICAM-1和ICAM-1的表現………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………128圖4-14、槲皮素改善IL-1β刺激ARPE-19細胞引起IL-6、IL-8、MCP-1、sICAM-1和ICAM-1的表現………………………………………………………………………………………………………………………………………………130圖4-15、槲皮素改善IL-1β刺激ARPE-19細胞引起IL-6、IL-8、MCP-1和ICAM-1 mRNA的表現………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………132圖4-16、槲皮素抑制IL-1β刺激ARPE-19細胞引起MAPKs及IKKα/β磷酸化的表現……133圖4-17、槲皮素抑制IL-1β刺激ARPE-19細胞引起c-Jun、ATF2、CREB和NF-κB (p65)磷酸化的表現…………………………………………………………………………………………………………………………………134圖4-18、MAPK和NF-κB抑制劑對IL-1β刺激ARPE-19細胞引起IL-6、IL-8、MCP-1、sICAM-1和ICAM-1蛋白質表現的抑制作用……………………………………………………………………………………135圖

4-19、MAPK和NF-κB抑制劑對IL-1β刺激ARPE-19細胞引起IL-6、IL-8、MCP-1和ICAM-1 mRNA表現的抑制作用………………………………………………………………………………………………………………137圖4-20、槲皮素減少IL-1β刺激ARPE-19細胞產生的NF-κB (p65)轉位至細胞核……138圖4-21、槲皮素減少IL-1β刺激ARPE-19細胞誘導THP-1細胞黏附作用…………………………139圖4-22、槲皮素改善IL-1β刺激ARPE-19細胞引起IL-6、IL-8、MCP-1、sICAM-1和ICAM-1表現的訊息傳遞路徑示意圖……………………

……………………………………………………………………………140表目錄表1-1、人類MMPs分類………………………………………………………………………………………………………………………………56表1-2、人類MMPs在眼組織及眼疾病的關係……………………………………………………………………………………57表3-1、本論文使用之化學物品與試劑………………………………………………………………………………………………66表3-2、本論文使用之抗體………………………………………………………………………………………………………………………67表3-3、本論文使用之RT-PCR primers……………

………………………………………………………………………………72表3-4、本論文使用之Real-time PCR primers…………………………………………………………………………73表3-5、ELISA樣品及標準品的稀釋倍率……………………………………………………………………………………………74

微藻萃取物藉由下調節未摺疊蛋白質反應降低口腔癌細胞增生

為了解決small zipper pouch p的問題，作者蔡雅如 這樣論述：

微藻內含有多種具生物活性的化合物，包含胡蘿蔔素、脂肪酸、醣脂質、多醣類、蛋白質與胜肽類。巨藻與微藻已被應用在抗癌研究中，許多藻類的粗萃取物或純化之化合物已顯示具有抗腫瘤之活性。在此研究中，我們使用Coelastrella sp. F50 (C. F50)，一株分離自台灣的微藻的有機萃取物來探討其對兩株由本土患者所建立之口腔癌細胞株(OC2和OCSL)的抗癌效果。我們發現C. F50萃取物隨著時間與劑量的上升可以降低OC2及OCSL細胞的生存率，其半致死劑量約500 μg/ml。C. F50萃取物能抑制細胞遷移與上皮－間質型轉換（epithelial-mesenchymal transitio

n）及癌症幹細胞特性，也能增加細胞內的活性氧化物質（reactive oxygen species, ROS)。細胞內活性氧濃度上升通常亦會提升內質網壓力（ER stress）及未摺疊蛋白質反應（unfolded protein response, UPR）反應。令人意外地， C. F50萃取物雖能下調未摺疊蛋白質反應，卻能抑制細胞生長。我們推測C. F50萃取物可能會下調初期未摺疊蛋白質反應途徑，造成活性氧累積，因此容易觸發後期未摺疊蛋白質反應而造成細胞死亡。